مهم‌ترین مرحله پرورش دنبلان تهیه نهال تلقیح شده با اسپور ترافل است.
این مرحله از کار به ۲ روش انجام می‌گیرد:
۱- در شرایط کاملاً استریل
۲- در شرایط نیمه استریل
روش اول: در شرایط کاملاً استریل(در آزمایشگاه کشت بافت)
روش کاملاً استریل به آزمایشگاه کشت بافت مجهز به اتاق تلقیح با فشار هوای مثبت، هود لامینار ایرفلو، اتوکلاو، انکباتورهای مجهز به تنظیم خودکار دما،
رطوبت و میزان co2 و یک سری تجهیزات دیگر آزمایشگاهی نیاز دارد. این روش هزینه‌بر است و برای عموم مقدور نیست.
در این روش لازم است از نهال‌هایی که به روش کشت بافت و در شرایط کاملاً استریل رشد کرده‌اند استفاده کرد. مراحل کار به‌صورت مختصر به این صورت است که ابتدا در آزمایشگاه کشت بافت، در محیط کشت‌های ویژه‌ای مانند MS(موراشیگ و اسکوگ) نهال همزیست را در تعداد دلخواه تولید می‌کنند و آن را در محیط اینویترو قرار می‌دهند تا مراحل رشد خود را طی کند و به یک نهال کامل تبدیل شود. این کار به چندین ماه زمان نیاز دارد.
در مرحله بعدی نوبت به عمل تلقیح می‌رسد. اسپورهای کاملاً استریلی که قبلاً از بافت خود ترافل جدا شده‌اند را بر روی ریشه تلقیح می‌کنند. و یا از اسپوری که قبلاً به روش کشت بافت از ترافل تهیه شده است، استفاده می‌کنند و عمل تلقیح بر روی ریشه نهال را انجام می‌دهند.
عمل تلقیح در پرورش ترافل به در کنار هم قرار دادن اسپور ترافل و ریشه درخت میزبان می‌گویند به‌طوری که بعد از چند ماه(۲ الی ۳ ماه) اسپور با ریشه نهال همزیست ارتباط برقرار کرده و عمل تشکیل مایکوریزا انجام می‌گیرد. نتیجه این کار تشکیل گره‌های کوچکی از اسپوروکارپ ها(ترافل‌های بسیار ریز) بر روی ریشه است که همین ترافل‌های ریز با تغذیه از طریق ریشه نهال درخت میزبان تبدیل به ترافل بالغ و قابل برداشت خواهد شد.
روش دوم: در شرایط نیمه استریل(در نهالستان کشت ترافل)
در روش نیمه استریل، به تجهیزاتی مانند اتوکلاو، خاک‌های مخصوص گلخانه مانند: پیت موس، ورمیکولایت، کوکوپیت، پالم پیت، خاک باغچه و همچنین یک سری ابزار و وسایل دیگر مانند سنگ آهک و گچ هیدراته، گلدان‌های پلی‌اتیلنی و … نیاز داریم.
در این روش ابتدا به کمک اتوکلاو ابزارآلات کار و خاک مورد استفاده برای کشت را کاملاً استریل می‌کنیم. به‌جای اتوکلاو می‌توان از دیگ بخار خانگی استفاده کرد. اگرچه کارایی اتوکلاو را ندارد اما با کمی دقت در کار می‌توان تا حد زیادی ابزار و موارد مورد استفاده را استریل کرد.
چرا به این روش نیمه استریل می‌گویند؟
از آنجا که در این روش اتاق کشت با فشار هوای مثبت و هود لامینار ایرفلو در اختیار نداریم، لذا کشت در یک اتاق غیر استریل انجام می‌شه که ممکن است باکتری، ویروس یا قارچ‌های رقیب موجود در هوا وارد خاک کشت شود. و چون در این روش خاک و ابزارآلات را می‌توان استریل کرد اما نمی‌توان از ورود میکروارگانیزم‌های هوابرد (موجودات ریز داخل هوا)به داخل خاک جلوگیری کرد، به این روش نیمه استریل می‌گویند.
یعنی در واقع ما بخشی از کار را به‌صورت استریل انجام می‌دهیم(استریل کردن خاک و ابزارآلات و حتی ریشه نهال همزیست) اما نمی‌توانیم شرایط کاملاً استریل را برای کشت فراهم کنیم. این روش، عمومی‌ترین روشی است که در اکثر نهالستان‌های تولید نهال تلقیح شده ترافل انجام می‌گیرد.در این روش ممکن است از نهال و یا دانه نهال میزبان برای تلقیح استفاده شود. بهتر است از نهال‌های ۱ تا ۲ ماهه برای عمل تلقیح استفاده شود.
دستورالعمل مختصر روش دوم:
۱- ابتدا در خاک‌های مخصوص گلخانه (مثلاً ترکیبی از ورمیکولایت، پیت موس، خاک باغچه و آهک یا گچ کوره نرفته به نسبت‌های معین ) دانه‌های نهال میزبان را کشت می‌کنند. هنگامی که نهال‌ها به حد کافی رشد کردند، عمل تلقیح ریشه‌ها را انجام می‌دهند. نهال‌های دوماهه را از داخل خاک درآورده و ریشه آن‌ها را در داخل سطل بزرگی از آب به‌صورت چرخشی می‌چرخانند تا تمام خاک‌های روی ریشه شسته شوند.
سپس با آب مقطر دو بار تقطیر ریشه را چندین بار(۲ الی ۳ بار) کاملاً شستشو می‌دهند و سپس ریشه نهال را به مدت ۳۰ ثانیه آب‌اکسیژنه(H2O2) در آب‌اکسیژنه(پراکسید هیدروژن) قرار می‌دهند تا استریل گردد.
۲- در این مرحله ترکیبی از خاک‌های مختلف را باهم مخلوط کرده و با استفاده از اتوکلاو کاملاً استریل می‌کنند.
۳- سوسپانسیونی از ترافل، شکر آهک و پودر زغال سیاه درشت می‌کنند. این سوسپانسیون در صنعت پرورش ترافل، مایع تلقیح یا مایع ترافل نام دارد.
۴- سوسپانسیون را با خاک تهیه شده در مرحله ۲ به‌صورت همگن کاملاً مخلوط می‌کنند و سپس نهال‌های میزبان را در آن کشت می‌کنند.
به این پروسه ۴ مرحله‌ای در اصطلاح پرورش قارچ ترافل عمل تلقیح می‌گویند. جزئیات کامل‌تر و دقیق‌تری از این روش و ابزارها و مواد لازم جهت کار، در کتاب رام کردن دنبلان( ترافل) ترجمه مهندس صباح پشدادی آورده شده است.
مزایا و معایب هردو روش:
مزیت روش اول این است که در شرایط کاملاً کنترل شده و استریل تمام مراحل کار انجام می‌شود و درصد خطای کار بسیار پایین است.
بزرگ‌ترین عیب این روش این است که نیاز به یک آزمایشگاه کشت بافت بسیار مجهز داریم، و پروسه تولید نهال از روش دوم زمان‌برتر است(حدود ۳ تا ۶ ماه بیشتر زمان نیاز است).
مزیت روش دوم این است که اولاً به تجهیزات زیادی نیاز نداریم و ثانیاً برای عموم متخصصین و حتی افراد عادی که آزمایشگاه و تجهیزات کامل در اختیار ندارند نیز قابل انجام است.
اما عیب این کار این است که شرایط کاملاً کنترل شده نیست و ممکن است ریشه نهال میزبان با انواع قارچ‌ها و باکتری‌های رقیب ترافل آلوده شود و درصد خطای کار را بالا می‌برد.
اگر این مقاله را دوست داشتید، لینک آن را در یکی از رسانه‌های خود قرار بدهید.
