تکنیک‌های نوین کشت و تولید ترافل

تکنیک‌های نوین کشت و تولید ترافل

اگرچه روش تالون بیشتر از ۱۵۰ سال پایه پرورش ترافل سیاه فرانسوی بود اما این روش بسیار ناقص و ناکارآمد است و امروزه دیگر توجیه اقتصادی ندارد زیرا نهال‌ها با انواع آفات و بیماری‌ها مانند نماتدها، حشرات و همچنین قارچ‌های همزیست رقیبی که سرعت رشدشان بسیار سریع‌تر است، آلوده می شوند.

در سال ۱۹۶۰ با تلاش دوباره برای پرورش ترافل، نیاز شدیدی به یک روش جدید و کارآمدتر احساس می‌شد. در آن زمان از روش مستقیم کاشتن ترافل در زیر درختان (مانند کاشتن سیب‌زمینی) استفاده می‌کردند که از روش تالون بهتر بود زیرا تالون دانه درختانی را که امکان داشت هیچ بذری روی آن نباشد، می‌کاشت. سینگر (۱۹۶۱) می‌نویسد: موج جدید پیشرفت‌ها، روش‌های جدید کنترل بیماری‌ها و تطابق‌های اصولی و عقلانی و بررسی‌های تئوری و آزمایش‌های عملی پرورش ترافل در اروپا و سراسر جهان در طول قرن بیستم، تکاپوی جدیدی برای پرورش ترافل در فرانسه جنوبی به وجود آورد.

اواخر سال ۱۹۶۰ دانشمندان فرانسوی و ایتالیایی به بررسی روش‌های جدیدی برای تولید نهال‌های آغشته به ترافل، تحت شرایط کنترل‌شده گلخانه‌ای پرداختند که در این روشهای نوین، نهال‌ها را با ترافل خالص، اسپور ترافل، کشت بافت و یا با بخشی از ریشه‌های درختان آغشته به ترافل تلقیح می‌کردند.

عاقبت این تلاش‌ها نتیجه‌بخش بود و در دسامبر ۱۹۷۷ اولین ترافل ها در اگریمونت فرانسه برداشت شد. دانشمندان ایتالیایی و فرانسوی عاقبت نفس راحتی کشیدند. اما دانشمندان اسپانیایی هم بی‌کار ننشستند و اولین مزارع ترافل را اوایل سال ۱۹۷۰ تأسیس کردند. البته اسپانیایی‌ها چندین دهه پیش ترافل های طبیعی را از جنگل‌هایشان برداشت می‌کردند.

امروزه روش‌های مدرن و کامل و دقیق کشت ترافل توسط کمپانی‌های بزرگ، برای تولید سالیانه هزاران هزار نهال‌ تلقیح شده با ترافل انجام می‌گیرد و آن را به‌صورت یک راز بزرگ پنهان می‌کنند. اگرچه روش‌های عمومی و کاربردی امروزه به‌خوبی مستند شده‌اند، اما این مستندات فقط در دسترس کمپانی هایی معدود است. ما در اینجا سعی می کنیم روش کامل این کار را برای شما توضیح ‌دهیم.

تولید نهال تلقیح شده ترافل با استفاده از اسپور

هرساله بحث زیادی می‌شود در مورد اینکه در مزرعه‌های کوچک تعدادی اندک نهال ملقح تولید کنیم بهتر است؛ یا این‌که ده‌ها هزار نهال آغشته به ترافل را که عاری از هر نوع آلاینده باشد؟ خیلی‌ها معتقدند انتشار جزئیات روش منتشرشده سال ۱۹۶۰ تا ۱۹۷۰ کار درستی نیست چون این روش مقرون‌به‌صرفه نیست و کسی که از آن استفاده می‌کند دچار زیان اقتصادی خواهد شد.

اما سرانجام در سال ۱۹۷۶ توسط مانوزی تورینی(Mannozzi Torini) بر اساس آزمایش‌های انجام شده در سال‌های ۱۹۶۵ تا ۱۹۷۶ مجموعه‌ای دستورالعمل منتشر شد. روش مانوزی تورینی توسط دانشمندان اصلاح گردید و روش جدیدی در سال ۱۹۸۲ توسط بنچوانگا(Bencivenga) و توکسینی(Toccini) منتشر شد. این روش‌ها و اصلاحات، بعدها در سال ۱۹۹۲ توسط اَلساندرا زامبونلی(Alessandra Zambonelli) و روزیلا دی میونو(Rozella Di Munno) خلاصه شد.

دستورالعمل این روش  که توسط زامبونلی و دی میونو خلاصه‌شده است به‌صورت زیر است:

۱- ابتدا میوه‌های بلوط را به مدت ۲۰ دقیقه در محلول ۱ درصد نیترات نقره غرق می‌کنیم تا پوسته آن کاملاً استریلیزه شود، سپس توسط آب مقطر استریلیزه شستشو می‌دهیم تا نیترات نقره کاملاً از پوسته آن پاک شود. زیرا در غیر این صورت نیترات نقره مانع از رشد اسپور ترافل بر روی آن می‌شود. این بلوط‌ها را یا فوری برای تلقیح استفاده می‌کنیم و یا آن را در ماسه استریل فرومی‌بریم تا بعداً استفاده شود.

۲- ترافل های مرغوبی را که بالغ و رسیده باشند برای تولید اسپور انتخاب کرده و کاملاً بررسی می‌کنیم که برای این کار مناسب باشند و آن‌ها را با آب استریل خوب شستشو می‌دهیم تا تکه‌های خاک از سطح آن پاک‌ شوند. ترافل ها را در یک شیشه آب استریل قرار می‌دهیم و برای چند روز به حال خود می‌گذاریم تا مانند حالت فاسد شدن طبیعی آن در طبیعت، فاسد (فرسوده) ‌شوند. (آب به تسریع این کار کمک می‌کند.)

۳- یک کیلوگرم شکر را به ۲۰ لیتر مخلوط آب و ترافل که از قبل آماده‌شده است، اضافه می‌کنیم تا حالتی چسبناک‌تر به خود بگیرد(سوسپانسیون شکر و ترافل)

۴- ۳ عدد از بلوط‌هایی که قبلاً در مرحله ۱ استریل کرده‌ایم جدا کرده و با محلول شکر و ترافل که از قبل در مرحله ۲ آماده کرده بودیم آغشته می‌کنیم تا حداقل ۲ تا ۳ گرم ترافل بر روی هر دانه بلوط قرار بگیرد. این بلوط‌ها را در بطری‌های حاوی ۲ تا ۳ کیلوگرم خاک طبیعی ترافل (خاک را قبلاً در اتوکلاو در دمای ۸۰ درجه سانتی‌گراد به مدت ۲ تا ۳ ساعت حرارت می دهیم تا استریل شود و همه آلاینده‌های آن کشته شوند و بعداز سرد شدن استفاده می کنیم.) می‌کاریم.

زامبونلی و دی میونو اصلاحات زیر را در این روش انجام داده‌اند:

۱- به‌جای دانه‌های بلوط، نهال‌های جوان و استریلیزه که در خاکی کاملاً استریل(ورمی کولایت یا پرلیت) همراه با مواد مغذی رشد کرده‌اند را با اسپور ترافل آغشته می‌کنیم.

۲- محلول سوسپانسیون ترافل را باهم زدن(استفاده از همزن برقی می‌تواند مفید باشد) کاملاً همگن می‌کنیم تا اسپورهای ترافل از کیسه‌هایی(asci) که در آن شکل‌گرفته‌اند، رها شوند.

۳- سرانجام گلدان‌های حاوی مخلوط خاک ‌کشت را در دمای ۱۲۱ درجه سانتی‌گراد به مدت ۴ ساعت در داخل اتوکلاو حرارت دهیم و همچنین تلقیح ریشه‌ها را در شرایط و محیط کنترل‌شده و کاملاً استریل انجام می‌دهیم.

این اصلاحات چند فایده دارد:
یک: استفاده کردن از نهال به‌جای دانه‌ها باعث می‌شود که اسپورهای محلول ترافل فوری بر روی ریشه‌ها بچسبند و تشکیل مایکوریزا دهند.
دو: همگن کردن محلول باعث می‌شود که ریشه‌ها به‌طور مؤثرتری آغشته شوند و درصد موفقیت بالاتر رود.
سه: دقت و توجه زیاد به شرایط و تلقیح و آغشتن در شرایط استریل به ما اطمینان بیشتری می‌دهد که قارچ‌های آلوده‌کننده رقیب کاملاً از بین رفته‌اند و این درصد موفقیت را تا حدود زیادی بالا می‌برد.

از اوایل ۱۹۸۰ به بعد اصلاحات دیگری نیز انجام گرفت که در زیر به آن‌ها اشاره می‌کنیم:

• ذخیره و انبار کردن ترافل در شرایط استریل و در سردخانه هنگامی‌که قیمت آن پایین است و استفاده از آن در بهترین زمان مناسب برای کشت. این کار قدرت جوانه‌زنی دنبلان را بالا می‌برد. زیرا به خاطر تأثیر میکروارکانیزم ها و ترشح التهابی ریشه‌ها، اسپورها نیازی نیست که از کیسه‌ها رها شوند و به آسانی جوانه می‌زنند.
• استفاده از تعداد شمارش‌شده‌ای از اسپور به‌جای استفاده از وزن مشخصی از ترافل برای هر نهال. زیرا تعداد اسپورهای موجود در یک گرم محلول ترافل، از ترافلی به ترافل دیگر متفاوت است و مقدار ترافل اضافه‌شده به محلول روی نتیجه کار تأثیرگذار است.
• آغشته کردن نهال‌ها با مقدار اقتصادی‌تر و مشخص‌تری از ترافل مثلاً ۱ گرم ترافل شامل تا  اسپور ترافل است. آغشته سازی با  اسپور برای هر نهال احتمال موفقیت را تا حدود زیادی پایین می‌آورد.
• استفاده از اسپور منجمد شده و یا اسپور خشک‌شده یا اسپور خشک منجمد برای آغشته سازی نهال‌ها.
• استریل کردن دانه‌های کاشته شده قبل از کشت با محلول هیپوکلریت سدیم یا پراکسید هیدروژن(آب‌اکسیژنه)
• مخلوط کردن ورمیکولایت استریل به نسبت ۱ به ۶ در محلول اسپور ترافل برای توزیع همگن‌تر آن بر روی ریشه‌ها.
• جایگزینی خاک به‌کاربرده شده با مخلوط‌های بدون خاک استریل مانند: ترکیب پیت- ورمیکولایت یا ترکیبی از پیت-پرلیت-سنگ‌آهک به پیمانه‌های مساوی و یا ترکیبی از ۲۰ درصد خاک خشک مخصوص یا رندزینا(Rendzina) و ۳۰ درصد پیت یا کمپوست و ۵۰ درصد ورمیکولایت با دولامیت برای بالا بردن PH و این ترکیب را با پوششی از کود گرانوله ضعیف بپوشانیم.
• استفاده از انواع گلدان‌های متفاوت مانند جعبه‌های پلاستیکی مربعی،کیسه‌های سلولوزی،کیسه‌های پلیتنی سیاه و طبقه‌های پلیتنی سیاه که در اطراف آن شیارهایی برای رفت‌وآمد هوا وجود دارد.
• استفاده از گلدان‌های کوچک‌تر که کمتر از ۱ کیلوگرم خاک بگیرند تا فضای کمتری در گلخانه را اشغال کنند و بتوان جعبه‌های بیشتری را جا داد.
• دو بار حرارت دادن گلدان‌ها قبل از مصرف در دمای ۱۰۰ درجه سلسیوس یا میکروب‌کشی کردن ترکیب خاک با اضافه کردن محلول متیل برومیل، جهت کنترل بیشتر آلوده‌کننده‌ها بعد از تلقیح(آغشتن)

                           

بهرحال هرچقدر  هم که این روش‌ها پیشرفته باشند، باغبان یا مدیر کنترل‌کننده گلخانه باید همیشه تک‌به‌تک نهال‌ها را ازنظر آلودگی بررسی کند. درواقع هر نوع سهل‌انگاری در مراقبت، باعث می‌شود که تعداد نهال‌های تلقیح نشده‌ زیاد شوند و یا اینکه نهال‌هایی که اسپور به‌صورت کامل روی آن‌ها رشد نکرده را به مزرعه منتقل کنیم. این کار باعث می‌شود قارچ‌های رقیب، سریع ریشه‌ها را آلوده کنند و این ازنظر اقتصادی هزینه‌های جبران‌ناپذیری را بر پروژه تحمیل می‌کند که ممکن است منجر به شکست پروژه شود.

گاهی اوقات بعضی از پرورش‌دهندگان ترافل برای صرفه‌جویی اقتصادی از مقدار کمتری اسپور برای تلقیح استفاده می‌کنند تا بتوانند باقیمت کمتری آن را به فروش برسانند و این ضربه بزرگی به اعتبار کاری آن‌ها وارد می‌کند زیرا نهال‌ها از مرغوبیت کافی برخوردار نخواهند بود و درصد جوانه‌زنی پایین می‌آید و مشتری‌ها از دست وی ناراضی خواهند بود که در درازمدت اعتبار آن‌ها خدشه‌دار خواهد شد.

تا اینجا روش تلقیح از طریق اسپور برای تولید تجاری نهال آغشته به اسپور گونه‌های T.Melanosporum,T.orchii,T.aestivum,T.brumale,T.macrosporum را توضیح دادیم. این روش همچنین برای گونه T.magnatum نیز آزمایش‌شده است اما به کار بردن مقدار کم اسپور برای این‌گونه، باعث ایجاد مشکل می‌شود تا جایی که  میکروارگانیسم‌های آلوده‌کننده رقیب آن را از بین می‌برند. پس دقت داشته باشید که باید مقدار بیشتری اسپور استفاده شود.

علاوه بر روش‌های معمول کاشت ترافل در اسپانیا، محققان والنسیا و بارسلونا تلاش‌هایی برای تلقیح درختان بلوط و فندق طبیعی انجام داده‌اند. برای این کار ریشه درختان را با دستگاه‌ها از خاک بیرون می‌کشند و ریشه و خاک اطراف آن را یا استریل می‌کنند و یا بدون استریل کردن، ریشه را با حجم زیادی از اسپور آماده آغشته کرده و دوباره در زیر خاک قرار داده سپس آن را آبیاری می‌کنند. مزارع ترافل زیادی با این روش تأسیس‌شده‌اند اما هنوز زود است که قضاوت کنیم که آیا این روش توجیه اقتصادی دارد یا نه.

شاید برای شما هم این سؤال پیش بیاید که آیا استفاده از ترافل‌های کوچک و نامرغوب برای تلقیح باعث تولید ترافل کوچک و نامرغوب می‌شود؟ برای پاسخ به این سؤال  هنوز اطلاعات دقیقی در دسترس نیست اما عاقلانه‌تر آن است که نهال‌ها را با مرغوب‌ترین و بهترین نوع ترافل ها تلقیح کنیم.

استفاده از گونه شناخته‌شده دلخواه باعث می‌شود که احتمال رویش گونه اشتباه ترافل نیز از بین برود. خطر این کار زمانی بیشتر می‌شود که با ترافل ارزان‌قیمت یا قطعه‌های کوچک ترافل یا قطعه‌های خشک‌شده ترافل از منبعی نامعلوم برای تلقیح استفاده کنیم. به‌علاوه تشخیص نوع و گونه یک ترافل ۲۰۰ گرمی خیلی آسان‌تر از بازشناختن ۲۰ ترافل کوچک ۱۰ گرمی است.

پس هنگام شروع کار حتماً به این نکات ریز توجه دقیقی داشته باشید تا بعداً با مشکل روبه‌رو نشوید.

اصلاح روش تالون

اگرچه تلقیح با استفاده از اسپور، روش ترجیحی اکثر گلخانه‌های تولید نهال ترافل است اما روش‌های دیگری نیز از سال ۱۹۶۰ به بعد برای این کار ابداع شد. یکی از این روش‌ها، استفاده از گیاه مادر است که بر اساس روش تالون استوار است.

نهال‌های تلقیح نشده با نهال‌های ملقح به ترافل در کنار هم و در اتاق‌های کنترل‌شده استریل کاشت می‌شوند. یک روش مشابه هم توسط کاوالیری و گرنتا(۱۹۷۳) توصیف‌شده است که توسط هال(۱۹۷۳) برای نهال‌های همزیست درونی توسعه یافت و به دنبال آن توسط جیوانتی(۱۹۸۰) این روش بدون استفاده از گیاه مادر، ثبت و منتشر شد. در این روش به‌جای استفاده از گیاه مادر، ریشه آغشته به اسپور را از نهال مادر جدا کرده و کنار ریشه استریل نهال جدید می‌کاریم.

لوبو و همکارانش(۱۹۹۰) از این تکنیک استفاده کردند. آن‌ها از بطری‌های استریل پلی اکریل آمید که کناره‌های آن دارای درز بودند برای نهال‌های آغشته استفاده کردند و اجازه دادند که ریشه‌های آغشته از کناره‌های گلدان بیرون بیاید و آز این ریشه‌های آغشته برای تلقیح نهال‌های جدید استفاده می‌کردند. به‌هرحال توجیه اقتصادی این روش‌های هزینه‌بردار و گران هنوز باید اثبات شود.

روش‌های جدید، به آسانی وابستگی به نهال مادر را حل کردند. به‌جای استفاده از ریشه تلقیح شده، از ریشه‌های دگرگون‌شده‌ای که می‌توانند بدون جوانه هم رشد کنند، استفاده می‌کنند. این روش برای قارچ‌های آربسکولار(همزیست درونی) هم به‌کاربرده می‌شود. واردا کاجان زور(Varda Kagan- Zur) و همکارانش (۲۰۰۲) این روش را ابداع کرده‌اند. نهال بدون ریشه راکوب(Cistus Incanus) را با آگروباکتریوم ریزوژن(agrobacterium rhizogenes)(یک نوع باکتری که محرک ریشه است و باعث تحریک ریشه بعضی درختان و ریشه‌زایی می‌شود.) آغشته کردند.

تارهای نازک و ظریف پرزدار ریشه از نقاط تلقیح ‌شده به A.rhizogen، ۸ تا ۱۱ روز بعد از تلقیح پدیدار شدند و سپس به‌طور جداگانه، ‌این ریشه‌ها به محیط کشت مایع آنتی‌بیوتیک‌دار منتقل شدند. این ریشه‌ها سپس به محیط کشت جامد با غلظت کمتر نیترات و آنتی‌بیوتیک منتقل شدند و سپس به محیط کشت جامد آماده‌شده برای نهال‌های اکتومایکوریزا انتقال یافتند.

ریشه‌های کشت‌ شده حتی بعد از چندین ماه به حیات خود ادامه دادند و بدون محیط کشت رشد خوبی از خود نشان دادند. سپس یک قطعه آگار آغشته به میسلیوم تازه ترافل سیاه فرانسوی را در وسط ریشه‌هایی که در محیط کشت جامد رشد کرده بودند  قراردادند. تقریباً ۳ ماه بعد، تجمع مایکوریزایی در طول ریشه‌های کشیده شده گسترش یافت و دو ماه بعد، ریشه‌های خاج مانند ترافل کاملاً قابل‌مشاهده بود. امروزه  این تکنیک‌ها تا جایی گسترش‌یافته‌اند که به‌راحتی می‌توان به‌صورت تجاری از آن‌ها استفاده کرد.

تلقیح نهال با کشت‌های میسلیوم

در سال ۱۹۰۳ لوئیس ماتراچوت(Louis Matruchot) برای اولین بار توانست در آزمایشگاه با استفاده از کشت بافت، میسلیوم خالص ترافل سیاه فرانسوی(Perigord Black Truffle) را تولید کند. بعد از او جرارد چیوالیر(Gerard Chevalier) یک روش جدید تلقیح نهال با اسپورهای جوانه‌زده یا میسلیوم در محفظه‌های مخصوص ابداع کرد. الساندرا زامبونلی و همکارانش در سال ۱۹۸۹ روش‌های نوین را بیشتر اصلاح و توسعه دادند و روش‌های استانداردی برای تلقیح نهال‌ها در لوله آزمایشگاه با استفاده از کالچر مایسیلیوم که از میوه ترافل بیانچیتو(Bianchetto) گرفته‌شده بود ابداع کردند. این تکنیک‌ها هنوز هم برای کشت ترافل زمستانی به‌کاربرده می‌شوند. آزمایش‌های مقدماتی نشان داده‌اند که با استفاده از این روش می‌توان با استفاده از میسلیوم  ترافل سیاه فرانسوی(Perigord Black Truffle) و ترافل بورگاندی(Burgundy) نهال‌های تلقیح شده تولید کرد.

در سال ۱۹۹۴ آسونسیون مورت(Asuncion Morte) و ماریو هونروبیا(Mario Honrubia) یک روش منحصربه‌فرد برای تلقیح گلسنگ (Helianthemum almeriense) با کالچر میسلیوم ترافل صحرایی(Terfezia claveryi) ابداع کردند که شبیه روشی بود که قبلاً در ایتالیا به کار می‌رفت. در این روش ابتدا گیاه H.almeriense را در شرایط (حرارت و نور) کنترل‌شده در محیط کشت بدون هورمون نگهداری می‌کنند.

کالچر میسلیوم ترافل T.claveryi از روش کشت بافت با PH 8 تهیه‌شده است. گیاه را با میسلیوم تلقیح کرده و در انکوباتور نگهداری می‌کنند تا مایکوریزا تشکیل شود. سپس گیاه را به محیط کشت جامد شامل ترکیبی از پیت-ورمیکولایت-شن با نسبت مساوی منتقل کرده و در گلخانه نگه‌داری می‌کنند.

به‌طور مشابه به همین روش گیاه بادمجان(Robinia pseudoacacia) را با قارچ (Mattirolomyces terfezioides) تلقیح می‌کنند. و همچنین گلسنگ H.ovatum را نیز به همین روش تلقیح می‌کنند که این دو مورد آخری کمی عجیب و موردی نادر به نظر می‌رسند.

چنین روش‌هایی از کشت بافت خالص، امروزه این امکان را فراهم کرده است که بتوان دنبلان(ترافل) را با روش تلقیح نهال‌های عاری از هر نوع آلودگی و در شرایط خاص آب‌وهوایی و ترکیبات خاک و انواع نهال میزبان به آسانی کشت و تولید کرد.